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細(xì)胞培養(yǎng)的具體流程詳述
點(diǎn)擊次數(shù):59 更新時間:2025-06-25

細(xì)胞培養(yǎng)是指將細(xì)胞從生物體中取出,置于合適的體外環(huán)境中,使其生長和繁殖的過程。這包括了原代培養(yǎng)(直接從生物體分離的細(xì)胞在人工培養(yǎng)環(huán)境中增殖)、傳代培養(yǎng)(將培養(yǎng)的細(xì)胞按一定比例稀釋并重新接種到新的培養(yǎng)器皿中)以及細(xì)胞系和細(xì)胞株的建立。細(xì)胞培養(yǎng)的關(guān)鍵在于提供適宜的營養(yǎng)、生長因子、激素、氣體環(huán)境(如5% CO2和37℃)以及維持合適的pH和滲透壓。細(xì)胞根據(jù)其生長特性可以分為貼壁生長和懸浮生長兩種類型。貼壁生長細(xì)胞需要附著在支持物表面才能生長,而懸浮生長細(xì)胞則可以在懸浮狀態(tài)下增殖。細(xì)胞培養(yǎng)過程中,需要關(guān)注細(xì)胞的傳代次數(shù),因?yàn)楦邆鞔鷶?shù)可能導(dǎo)致細(xì)胞的生長速度和形態(tài)發(fā)生變化。此外,細(xì)胞培養(yǎng)員需要具備無菌操作技能,嚴(yán)格遵循操作流程,以避免污染和細(xì)胞死亡。細(xì)胞培養(yǎng)在生物技術(shù)、醫(yī)學(xué)研究和藥物生產(chǎn)中具有重要作用,但其工作強(qiáng)度大,需要細(xì)致的日常管理和實(shí)驗(yàn)記錄。

下面詳述細(xì)胞培養(yǎng)的具體流程:

一、準(zhǔn)備工作

準(zhǔn)備工作對開展細(xì)胞培養(yǎng)異常重要,工作量也較大,應(yīng)給予足夠的重視,推備工作中某一環(huán)節(jié)的疏忽可導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗或無法進(jìn)行。準(zhǔn)備工作的內(nèi)容包括器皿的清洗、干燥與消毒,培養(yǎng)基與其他試劑的配制、分裝及滅菌,無菌室或超凈臺的清潔與消毒,培養(yǎng)箱及其他儀器的檢查與調(diào)試。

二、取材

在無菌環(huán)境下從機(jī)體取出某種組織細(xì)胞(視實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩ǎ?,?jīng)過一定的處理(如消化分散細(xì)胞、分離等)后接入培養(yǎng)器血中,這一過程稱為取材。如是細(xì)胞株的擴(kuò)大培養(yǎng)則無取材這一過程。機(jī)體取出的組織細(xì)胞的首ci培養(yǎng)稱為原代培養(yǎng)。

理論上講各種動物和人體內(nèi)的所有組織都可以用于培養(yǎng),實(shí)際上幼體組織(尤其是胚胎組織)比成年個體的組織容易培養(yǎng),分化程度低的組織比分化高的容易培養(yǎng),腫瘤組織比正常組織容易培養(yǎng)。取材后應(yīng)立即處理,盡快培養(yǎng),因故不能馬上培養(yǎng)時,可將組織塊切成黃豆般大的小塊,置4℃的培養(yǎng)液中保存。取組織時應(yīng)嚴(yán)格保持無菌,同時也要避免接觸其他的有害物質(zhì)。取病理組織和皮膚及消化道上皮細(xì)胞時容易帶菌,為減少污染可用抗菌素處理。

三、培養(yǎng)

將取得的組織細(xì)胞接入培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板中的過程稱為培養(yǎng)。如系組織塊培養(yǎng),則直接將組織塊接入培養(yǎng)器皿底部,幾個小時后組織塊可貼牢在底部,再加入培養(yǎng)基。如系細(xì)胞培養(yǎng),一般應(yīng)在接入培養(yǎng)器皿之前進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),按要求以一定的量(以每毫升細(xì)胞數(shù)表示)接入培養(yǎng)器皿并直接加入培養(yǎng)基。細(xì)胞進(jìn)入培養(yǎng)器皿后,立即放入培養(yǎng)箱中,使細(xì)胞盡早進(jìn)入生長狀態(tài)。

正在培養(yǎng)中的細(xì)胞應(yīng)每隔一定時間觀察一次,觀察的內(nèi)容包括細(xì)胞是否生長良好,形態(tài)是否正常,有無污染,培養(yǎng)基的PH是否太酸或太堿(由酚紅指示劑指示),此外對培養(yǎng)溫度和CO2濃度也要定時檢查。

原代培養(yǎng)一般有一段潛伏期(數(shù)小時到數(shù)十天不等),在潛伏期細(xì)胞一般不分裂,但可貼壁和游走。過了潛伏期后細(xì)胞進(jìn)入旺盛的分裂生長期。細(xì)胞長滿瓶底后要進(jìn)行傳代培養(yǎng),將一瓶中的細(xì)胞消化懸浮后分至兩到三瓶繼續(xù)培養(yǎng)。每傳代一次稱為“一代"。二倍體細(xì)胞一般只能傳幾十代,而轉(zhuǎn)化細(xì)胞系或細(xì)胞株則可無限地傳代下去。轉(zhuǎn)化細(xì)胞可能具有惡性性質(zhì),也可能僅有不死性(Immortality)而無惡性。

四、凍存及復(fù)蘇

為了保存細(xì)胞,特別是不易獲得的突變型細(xì)胞或細(xì)胞株,要將細(xì)胞凍存。凍存的溫度一般用液氮的溫度-196℃,將細(xì)胞收集至凍存管中加入含保護(hù)劑(一般為二甲亞砜或甘油)的培養(yǎng)基,以一定的冷卻速度凍存,最終保存于液氮中。在極低的溫度下,細(xì)胞保存的時間幾乎是無限的。復(fù)蘇一般采用快融方法,即從液氮中取出凍存管后,立即放入37℃水中,使之在一分鐘內(nèi)迅速融解。然后將細(xì)胞轉(zhuǎn)入培養(yǎng)器皿中進(jìn)行培養(yǎng)。

凍存過程中保護(hù)劑的選用、細(xì)胞密度、降溫速度及復(fù)蘇時溫度、融化速度等都對細(xì)胞活力有影響。

五、常用儀器設(shè)備

無菌室,超凈工作臺,三重純水蒸餾器,抽氣泵,壓力蒸氣消毒器,電熱恒溫培養(yǎng)箱,培養(yǎng)器具,CO2培養(yǎng)箱,恒溫水浴鍋,倒置顯微鏡,離心機(jī),無菌過濾器,洗刷裝置,細(xì)胞計(jì)數(shù)板和電子細(xì)胞技術(shù)儀等等。

 


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