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逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)實驗詳解
點擊次數(shù):128 更新時間:2024-10-21

       逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng) (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)的原理是:提取組織或細胞中的總RNA,以其中的mRNA作為模板,采用Oligo(dT)或隨機引物利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA。再以cDNA為模板進行PCR擴增,而獲得目的基因或檢測基因表達。

實驗步驟:

一、總RNA的提取
總RNA提取可以:(1)獲得高純度、高質(zhì)量的總RNA;(2)可以滿足生物學(xué)下游實驗Northern Blot、核酸酶保護實驗、RT-PCR、qRT-PCR 和陣列分析所需。


二、cDNA第一鏈的合成
目前試劑公司有多種cDNA第一鏈試劑盒出售,其原理基本相同,但操作步驟不一?,F(xiàn)以GIBICOL公司提供的SuperScriptTM Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis 試劑盒為例。

1. 在0.5 ml微量離心管中,加入總RNA 1-5 μg,補充適量的DEPC H2O使總體積達11 μl。在管中加10 μM Oligo(dT)12-18 1 μl,輕輕混勻、離心;

2.70℃加熱10min,立即將微量離心管插入冰浴中至少1min;

3. 取0.5 ml PCR管,依次加入下列試劑:第一鏈cDNA 2 μl;上游引物(10 pM) 2 μl;下游引物(10 pM) 2 μl;dNTP(2mM) 4 μl;10×PCR buffer 5 μl;Taq 酶(2 u/μl) 1 μl。輕輕混勻,離心。42℃孵育2-5 min;
4.加入SuperscriptⅡ1 μl ,在42℃水浴中孵育50 min;

5. 于70℃加熱15 min以終止反應(yīng);

6.將管插入冰中,加入RNase H 1 μl ,37℃孵育20 min,降解殘留的RNA。-20℃保存?zhèn)溆谩?br/>


三、PCR
1.取0.5 ml PCR管,依次加入下列試劑:第一鏈cDNA   2 μl;上游引物(10 pM)2 μl;下游引物(10 pM)2 μl;dNTP(2 mM) 4 μl;10×PCR buffer 5 μl;Taq 酶(2 u/μl)1 μl;

2.加入適量的ddH2O,使總體積達50 μl。輕輕混勻,離心;

3.設(shè)定PCR程序。在適當(dāng)?shù)臏囟葏?shù)下擴增28-32個循環(huán)。為了保證實驗結(jié)果的可靠與準(zhǔn)確,可在PCR擴增目的基因時,加入一對內(nèi)參(如G3PD)的特異性引物,同時擴增內(nèi)參DNA,作為對照;

4.電泳鑒定:行瓊脂糖凝膠電泳,紫外燈下觀察結(jié)果;

5.密度掃描、結(jié)果分析:采用凝膠圖像分析系統(tǒng),對電泳條帶進行密度掃描。


注意事項:

1.在實驗過程中要防止RNA的降解,保持RNA的完整性。在總RNA的提取過程中,注意避免mRNA的斷裂;

2. 為了防止非特異性擴增,必須設(shè)陰性對照;

3.內(nèi)參的設(shè)定:主要為了用于靶RNA的定量。常用的內(nèi)參有G3PD(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)、β-Actin(β-肌動蛋白)等。其目的在于避免RNA定量誤差、加樣誤差以及各PCR反應(yīng)體系中擴增效率不均一各孔間的溫度差等所造成的誤差;

4. PCR不能進入平臺期,出現(xiàn)平臺效應(yīng)與所擴增的目的基因的長度、序列、二級結(jié)構(gòu)以及目標(biāo)DNA起始的數(shù)量有關(guān)。故對于每一個目標(biāo)序列出現(xiàn)平臺效應(yīng)的循環(huán)數(shù),均應(yīng)通過單獨實驗來確定;

5. 防止DNA的污染: 采用DNA酶處理RNA; 在可能的情況下,將PCR引物置于基因的不同外顯子,以消除基因和mRNA的共線性。


其他:

1.反轉(zhuǎn)錄酶的選擇

(1) Money 鼠白血病病毒(MMLV)反轉(zhuǎn)錄酶:有強的聚合酶活性,RNA酶H活性相對較弱。最適作用溫度為37℃;

(2)禽成髓細胞瘤病毒(AMV)反轉(zhuǎn)錄酶:有強的聚合酶活性和RNA酶H活性。最適作用溫度為42℃;

(3)Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜熱微生物的熱穩(wěn)定性反轉(zhuǎn)錄酶:在Mn2+存在下,允許高溫反轉(zhuǎn)錄RNA,以消除RNA模板的二級結(jié)構(gòu);

(4)MMLV反轉(zhuǎn)錄酶的RNase H-突變體:商品名為Superscript 和SuperScriptⅡ。此種酶較其它酶能多將更大部分的RNA轉(zhuǎn)換成cDNA,這一特性允許從含二級結(jié)構(gòu)的、低溫反轉(zhuǎn)錄很困難的mRNA模板合成較長cDNA。

2.合成cDNA引物的選擇

(1) 隨機六聚體引物:當(dāng)特定mRNA由于含有使反轉(zhuǎn)錄酶終止的序列而難于拷貝其全長序列時,可采用隨機六聚體引物這一不特異的引物來拷貝全長mRNA。用此種方法時,體系中所有RNA分子全部充當(dāng)了cDNA第一鏈模板,PCR引物在擴增過程中賦予所需要的特異性。通常用此引物合成的cDNA中96%來源于rRNA。

(2) Oligo(dT):是一種對mRNA特異的方法。因絕大多數(shù)真核細胞mRNA具有3’端Poly(A+)尾,此引物與其配對,僅mRNA可被轉(zhuǎn)錄。由于Poly(A+)RNA僅占總RNA的1-4%,故此種引物合成的cDNA比隨機六聚體作為引物和得到的cDNA在數(shù)量和復(fù)雜性方面均要小。

(3)特異性引物:最特異的引發(fā)方法是用含目標(biāo)RNA的互補序列的寡核苷酸作為引物,若PCR反應(yīng)用二種特異性引物,第一條鏈的合成可由與mRNA 3’端最靠近的配對引物起始。用此類引物僅產(chǎn)生所需要的cDNA,導(dǎo)致更為特異的PCR擴增。

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